试剂酶联网
搜索
联系我们
 工作时间
周一至周五 :8:30-17:30
周六至周日 :9:00-17:00
 联系方式
手机①:15221858802
手机②:13816899465
电话①:021-60526354
电话②:021-60345312
电话③:021-60345367
邮箱①:shxysw01@163.com
邮箱②:shxysw02@163.com
邮箱③:shxysw02@126.com
传真:86-021-37680378
地址:上海市松江区卖新公路2077号3楼8306室(新九广场)
新闻详情

干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性

                        干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性

张宝芹(北京大学滨海医院、天津市第五中心医院消化科,天津市  300450)  引用本文:张宝芹. 干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性[J].中国组织工程研究,2017,21(9):1319-1323.  DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002      ORCID: 0000-0002-5015-9381(张宝芹)   文章快速阅读:

文题释义:  CD133:是一种重要的表面标志物,具有独特的信号传递通路,可参与到淋巴细胞再循环过程中,与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系。以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研 究。此次实验中,即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,获得CD133+/CD133- MHCC97-H细胞。  Notch信号途径:是一种细胞间相互作用的基本途径,调控着细胞增殖、分化、凋亡等过程。在Notch途径被激活时,干细胞发生增殖,活性受到抑制时,干细胞开始发生分化。   摘要  背景:以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。 目的:探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。  方法:对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,分别获得CD133+与CD133-MHCC97-H细胞,检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力;培养14 d,检测细胞克隆形成率;培养7 d,检测细胞增殖及Notch基因 蛋白表达。将CD133+与CD133-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下,4周后,检测成瘤情况。  结果与结论:①CD133表达与细胞克隆形成率:CD133+MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显 著大于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05);②细胞增殖:CD133+MHCC97-H细胞培养3-7 d的吸光度值大 于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05);③细胞迁移侵袭:CD133+MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细 胞数均显著多于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05);④Notch基因蛋白:CD133+MHCC97-H细胞Notch基 因蛋白表达多于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05);⑤成瘤实验:CD133-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于 CD133-MHCC97-H细胞组(P < 0.05);⑥结果表明:CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性,具有一定的肿瘤干细胞特性,并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。

0  引言  Introduction  肿瘤细胞中存在一定的肿瘤干细胞,这是一类特殊的细胞,具有很强的自我更新及分化能力。临床治疗中,肿瘤干细胞的敏感性不强,容易导致复发等情况的出现,影响预后效果[1]。为此,对肿瘤干细胞相关生物学特性进行分析,寻找有效的治疗靶点至关重要。肝癌是一种常见的恶性肿瘤,肝癌细胞中也存在一定的肿瘤干细胞[2]。在对肿瘤干细胞进行研究时,人类白细胞分化抗原133(CD133)是一种重要的表面标志物[3]。CD133具有独特的信号传递通路,可参与到淋巴细胞再循环过程中,与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系[4]。以CD133为标志物,利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中,即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选,获得CD133+/CD133- MHCC97-H细胞,并 观察其迁移侵袭、成瘤能力以及Notch基因蛋白的表达情况等,以探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外特性。   1  材料和方法  Materials and methods   1.1  设计  体外细胞观察性实验及随机对照动物实验。 1.2  时间及地点   实验于2015年8至12月在北京大学滨海医院实验室完成。  1.3  材料  人肝癌细胞株MHCC97-H由上海信裕生物技术有限公司提供;11周龄雄性BALB/c裸鼠10只,体质量20-25 g,SPF级,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SYXK(京)2013-0058。  主要试剂和仪器:DMEM培养基、兔抗人Notch单克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司);胎牛血清(上海钰博生物科技有限公司);CD133抗体(澳大利亚,Hyclone公司);胰蛋白酶(上海信裕生物科技有限公司);FCR封阻试剂(北京方程生物科技有限公司);CD133免疫微珠(北京德诺生物科技有限公司);Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司);MTT(上海沪震生物科技有限公司);细胞裂解液(上海普飞生物技术有限公司);PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司);Transwell 小室(上海博麦德生物科技有限公司);光学显微镜(上海市恒斐生物科技有限公司);流式细胞仪(上海雷浩信息科技有限公司);酶标仪(北京东胜创新生物科技有限公司)。 1.4  实验方法  1.4.1  肝癌细胞的培养  利用含胎牛血清的DMEM培养基对人肝癌MHCC97-H细胞株进行常规培养。观察细胞生长情况,待细胞大部分长满后进行传代培养。去掉培养液,PBS洗涤后添加胰蛋白酶进行消化。收集脱落细胞,添加完全培养基,置于培养瓶中进行培养。收集对数期细胞,进行后续实验。  1.4.2  肝癌细胞中的CD133表达率  对MHCC97-H细胞进行重悬,调整细胞浓度为1×109 L- 1后,添加CD133抗体 进行孵育。30 min后离心,再次重悬,上流式细胞仪进行检测,记录细胞CD133表达率。  1.4.3  CD133+/CD133- MHCC97-H细胞分选[5-6]  添加胰 蛋白酶对MHCC97-H细胞进行消化,进行细胞重悬,离心后去掉上清,再次进行细胞重悬。添加FCR封阻试剂和CD133免疫微珠,孵育后进行离心和细胞重悬,过柱后分别收集CD133+、CD133- 细胞。进行细胞计数和传代培养, 上流式细胞仪进行检测,对分选后细胞的CD133表达率进行检测和记录。  1.4.4  克隆形成实验[7]   对CD133+MHCC97-H细胞和CD133- MHCC97-H细胞进行稀释,接种在6孔板中。连续培养14 d,PBS洗涤后向各孔添加Giemsa染色液,置于镜下进行观察和细胞集落数计数,计算细胞克隆形成率。计算方法为:克隆形成率=集落数/细胞接种数×100%。 1.4.5  细胞体外增殖[8]  将CD133+MHCC97-H细胞和CD133-MHCC97-H细胞接种在96孔板上,添加含体积分数10%牛血清的DMEM培养液,连续培养7 d。每天利用MTT色法对各组细胞的增殖情况进行检测,记录490 nm的吸光度值,描绘体外生长曲线。  1.4.6  Transwell小室侵袭、转移实验[9]  利用无血清的DMEM培养液对CD133+MHCC97-H细胞和CD133 -  MHCC97-H细胞进行重悬,调整细胞浓度,利用Transwell小室进行侵袭和迁移实验。置于在光学显微镜下进行观察,对穿膜细胞进行计数。  1.4.7  干细胞相关基因蛋白的表达[10]  添加胰蛋白酶对增殖实验培养7 d的两组细胞进行消化,PBS洗涤后离心,去掉上清。添加细胞裂解液,再次离心收集上清。进行凝胶电泳,通过湿法电转移法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。添加兔抗人Notch单克隆抗体,置于4 ℃环境下。过夜后去掉一抗,添加二抗。常规曝光、显影、定影后利用图像软件检测两组的目的蛋白条带的光密度值,记录相对吸光度值。  1.4.8  裸鼠成瘤实验[11]  将10只裸鼠随机分为2组,每组5只。对CD133+MHCC97-H细胞和CD133-  MHCC97-H细胞 浓度进行调整,分别调整为1×106,1×107 L- 1,之后分别 接种于两组裸鼠背部皮下。接种完毕对裸鼠进行常规饲养,每日观察,连续观察4周。麻醉后处死两组裸鼠,即刻获得移植瘤标本,观察移植瘤大小,分析两组成瘤情况。 1.5  主要观察指标  不同细胞干细胞相关Notch基因蛋白表达情况、克隆形成率、迁移侵袭及成瘤能力。 1.6  统计学分析  研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件。计量资料符合正态分布的予以t 检验,不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。    2  结果  Results   2.1  不同MHCC97-H细胞亚群CD133表达及克隆形成情况  经分选,获得CD133+MHCC97-H细胞和CD133-   MHCC97-H细胞亚群。CD133+MHCC97-H细胞的CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133- MHCC97-H细胞 (P均< 0.05),见表1。

     

2.2  CD133+与CD133- MHCC97-H细胞体外增殖情况   CD133+MHCC97-H细胞培养3 d后的吸光度值显著大于CD133- MHCC97-H细胞(P < 0.05),见表2。观察细胞体外生长曲线,CD133+MHCC97-H细胞较为陡峭,CD133-  MHCC97-H细胞较为平缓,见图1。

       

       

         2.3  CD133+与CD133- MHCC97-H细胞的迁移、侵袭能力   CD133+MHCC97-H细胞迁移和侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133- MHCC97-H细胞(P < 0.05),见表3。             2.4  CD133+与CD133- MHCC97-H细胞的Notch基因蛋白表达  CD133+MHCC97-H细胞的Notch基因蛋白表达水平显著高于CD133- MHCC97-H细胞(0.89±0.05,0.15± 0.03,P < 0.05),蛋白条带光密度比较也存在明显差异,见图2。  2.5  CD133+与CD133-MHCC97-H细胞的成瘤能力   CD133+MHCC97-H细胞组、CD133- MHCC97-H细胞组 的裸鼠移植瘤体积分别为(1 203.12±185.23) mm3和(412.33±50.25) mm3,经比较组间差异有显著性意义  (P < 0.05)。

在线客服
 
 
 联系方式
陈军:021-60526354
小余:021-60345312
小吴:021-60345367