张宝芹(北京大学滨海医院、天津市第五中心医院消化科，天津市 300450) 引用本文：张宝芹. 干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群增殖特性[J].中国组织工程研究，2017，21(9):1319-1323. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002 ORCID: 0000-0002-5015-9381(张宝芹) 文章快速阅读：

文题释义： CD133：是一种重要的表面标志物，具有独特的信号传递通路，可参与到淋巴细胞再循环过程中，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系。以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中，即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，获得CD133+/CD133- MHCC97-H细胞。 Notch信号途径：是一种细胞间相互作用的基本途径，调控着细胞增殖、分化、凋亡等过程。在Notch途径被激活时，干细胞发生增殖，活性受到抑制时，干细胞开始发生分化。摘要背景：以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同的肿瘤干细胞进行分选和研究。目的：探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外增殖特性。方法：对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，分别获得CD133+与CD133-MHCC97-H细胞，检测CD133表达及细胞迁移侵袭能力；培养14 d，检测细胞克隆形成率；培养7 d，检测细胞增殖及Notch基因蛋白表达。将CD133+与CD133-MHCC97-H细胞分别接种于裸鼠背部皮下，4周后，检测成瘤情况。结果与结论：①CD133表达与细胞克隆形成率：CD133+MHCC97-H细胞CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；②细胞增殖：CD133+MHCC97-H细胞培养3-7 d的吸光度值大于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；③细胞迁移侵袭：CD133+MHCC97-H细胞迁移与侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；④Notch基因蛋白：CD133+MHCC97-H细胞Notch基因蛋白表达多于CD133-MHCC97-H细胞(P < 0.05)；⑤成瘤实验：CD133-MHCC97-H细胞组成瘤体积大于 CD133-MHCC97-H细胞组(P < 0.05)；⑥结果表明：CD133阳性肝癌细胞亚群具有较强的体外增殖特性，具有一定的肿瘤干细胞特性，并有较强的侵袭、转移及致瘤能力。

0 引言 Introduction 肿瘤细胞中存在一定的肿瘤干细胞，这是一类特殊的细胞，具有很强的自我更新及分化能力。临床治疗中，肿瘤干细胞的敏感性不强，容易导致复发等情况的出现，影响预后效果[1]。为此，对肿瘤干细胞相关生物学特性进行分析，寻找有效的治疗靶点至关重要。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，肝癌细胞中也存在一定的肿瘤干细胞[2]。在对肿瘤干细胞进行研究时，人类白细胞分化抗原133(CD133)是一种重要的表面标志物[3]。CD133具有独特的信号传递通路，可参与到淋巴细胞再循环过程中，与肿瘤细胞之间存在十分密切的联系[4]。以CD133为标志物，利用其蛋白特异性特征可对不同肿瘤干细胞进行分选和研究。此次实验中，即以CD133为标志物对人肝癌MHCC97-H细胞株进行培养和分选，获得CD133+/CD133- MHCC97-H细胞，并观察其迁移侵袭、成瘤能力以及Notch基因蛋白的表达情况等，以探讨干细胞表面标志CD133在肝癌中的表达及其阳性亚群的体外特性。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计体外细胞观察性实验及随机对照动物实验。 1.2 时间及地点实验于2015年8至12月在北京大学滨海医院实验室完成。 1.3 材料人肝癌细胞株MHCC97-H由上海信裕生物技术有限公司提供；11周龄雄性BALB/c裸鼠10只，体质量20-25 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2013-0058。主要试剂和仪器：DMEM培养基、兔抗人Notch单克隆抗体(北京博奥森生物科技有限公司)；胎牛血清(上海钰博生物科技有限公司)；CD133抗体(澳大利亚，Hyclone公司)；胰蛋白酶(上海信裕生物科技有限公司)；FCR封阻试剂(北京方程生物科技有限公司)；CD133免疫微珠(北京德诺生物科技有限公司)；Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司)；MTT(上海沪震生物科技有限公司)；细胞裂解液(上海普飞生物技术有限公司)；PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司)；Transwell 小室(上海博麦德生物科技有限公司)；光学显微镜(上海市恒斐生物科技有限公司)；流式细胞仪(上海雷浩信息科技有限公司)；酶标仪(北京东胜创新生物科技有限公司)。 1.4 实验方法 1.4.1 肝癌细胞的培养利用含胎牛血清的DMEM培养基对人肝癌MHCC97-H细胞株进行常规培养。观察细胞生长情况，待细胞大部分长满后进行传代培养。去掉培养液，PBS洗涤后添加胰蛋白酶进行消化。收集脱落细胞，添加完全培养基，置于培养瓶中进行培养。收集对数期细胞，进行后续实验。 1.4.2 肝癌细胞中的CD133表达率对MHCC97-H细胞进行重悬，调整细胞浓度为1×109 L- 1后，添加CD133抗体进行孵育。30 min后离心，再次重悬，上流式细胞仪进行检测，记录细胞CD133表达率。 1.4.3 CD133+/CD133- MHCC97-H细胞分选[5-6] 添加胰蛋白酶对MHCC97-H细胞进行消化，进行细胞重悬，离心后去掉上清，再次进行细胞重悬。添加FCR封阻试剂和CD133免疫微珠，孵育后进行离心和细胞重悬，过柱后分别收集CD133+、CD133- 细胞。进行细胞计数和传代培养，上流式细胞仪进行检测，对分选后细胞的CD133表达率进行检测和记录。 1.4.4 克隆形成实验[7] 对CD133+MHCC97-H细胞和CD133- MHCC97-H细胞进行稀释，接种在6孔板中。连续培养14 d，PBS洗涤后向各孔添加Giemsa染色液，置于镜下进行观察和细胞集落数计数，计算细胞克隆形成率。计算方法为：克隆形成率=集落数/细胞接种数×100%。 1.4.5 细胞体外增殖[8] 将CD133+MHCC97-H细胞和CD133-MHCC97-H细胞接种在96孔板上，添加含体积分数10%牛血清的DMEM培养液，连续培养7 d。每天利用MTT色法对各组细胞的增殖情况进行检测，记录490 nm的吸光度值，描绘体外生长曲线。 1.4.6 Transwell小室侵袭、转移实验[9] 利用无血清的DMEM培养液对CD133+MHCC97-H细胞和CD133 - MHCC97-H细胞进行重悬，调整细胞浓度，利用Transwell小室进行侵袭和迁移实验。置于在光学显微镜下进行观察，对穿膜细胞进行计数。 1.4.7 干细胞相关基因蛋白的表达[10] 添加胰蛋白酶对增殖实验培养7 d的两组细胞进行消化，PBS洗涤后离心，去掉上清。添加细胞裂解液，再次离心收集上清。进行凝胶电泳，通过湿法电转移法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。添加兔抗人Notch单克隆抗体，置于4 ℃环境下。过夜后去掉一抗，添加二抗。常规曝光、显影、定影后利用图像软件检测两组的目的蛋白条带的光密度值，记录相对吸光度值。 1.4.8 裸鼠成瘤实验[11] 将10只裸鼠随机分为2组，每组5只。对CD133+MHCC97-H细胞和CD133- MHCC97-H细胞浓度进行调整，分别调整为1×106，1×107 L- 1，之后分别接种于两组裸鼠背部皮下。接种完毕对裸鼠进行常规饲养，每日观察，连续观察4周。麻醉后处死两组裸鼠，即刻获得移植瘤标本，观察移植瘤大小，分析两组成瘤情况。 1.5 主要观察指标不同细胞干细胞相关Notch基因蛋白表达情况、克隆形成率、迁移侵袭及成瘤能力。 1.6 统计学分析研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件。计量资料符合正态分布的予以t 检验，不符合正态分布的予以单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results 2.1 不同MHCC97-H细胞亚群CD133表达及克隆形成情况经分选，获得CD133+MHCC97-H细胞和CD133- MHCC97-H细胞亚群。CD133+MHCC97-H细胞的CD133表达率、克隆形成率均显著大于CD133- MHCC97-H细胞 (P均< 0.05)，见表1。

2.2 CD133+与CD133- MHCC97-H细胞体外增殖情况 CD133+MHCC97-H细胞培养3 d后的吸光度值显著大于CD133- MHCC97-H细胞(P < 0.05)，见表2。观察细胞体外生长曲线，CD133+MHCC97-H细胞较为陡峭，CD133- MHCC97-H细胞较为平缓，见图1。

2.3 CD133+与CD133- MHCC97-H细胞的迁移、侵袭能力 CD133+MHCC97-H细胞迁移和侵袭实验的透膜细胞数均显著多于CD133- MHCC97-H细胞(P < 0.05)，见表3。 2.4 CD133+与CD133- MHCC97-H细胞的Notch基因蛋白表达 CD133+MHCC97-H细胞的Notch基因蛋白表达水平显著高于CD133- MHCC97-H细胞(0.89±0.05，0.15± 0.03，P < 0.05)，蛋白条带光密度比较也存在明显差异，见图2。 2.5 CD133+与CD133-MHCC97-H细胞的成瘤能力 CD133+MHCC97-H细胞组、CD133- MHCC97-H细胞组的裸鼠移植瘤体积分别为(1 203.12±185.23) mm3和(412.33±50.25) mm3，经比较组间差异有显著性意义 (P < 0.05)。