试剂酶联网
搜索
联系我们
 工作时间
周一至周五 :8:30-17:30
周六至周日 :9:00-17:00
 联系方式
手机①:15221858802
手机②:13816899465
电话①:021-60526354
电话②:021-60345312
电话③:021-60345367
邮箱①:shxysw01@163.com
邮箱②:shxysw02@163.com
邮箱③:shxysw02@126.com
传真:86-021-37680378
地址:上海市松江区卖新公路2077号3楼8306室(新九广场)
新闻详情

人外周血单核细胞分离技术

人外周血单核细胞分离技术

实验准备

一.人外周血单核细胞分离

1.     抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血

A:  20 mL于50 mL离心管中,以2 000 r /min离心20 min,吸弃上层血浆,获得下层沉淀细胞约10~12.5 mL。

2.     沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀

A 中的细胞中加入Hank′s液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 ~7.6)  体积比仍未1:1,混匀,制成细胞悬液。

B:  无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。

另取一离心管,加入LTS1077淋巴细胞分层液,然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面,使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为:1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min,离心结束后,取出离心管,可见管中液体已经分层。

管内可见分为4层:最上层是血浆,含部分血小板:第二层为薄薄的白膜层,主要台单个核细胞,还混杂有少量血小板;第三层为分离液层;第四层为粒细胞及红细胞,红细胞沉于管底,而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜

3.       单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁

吸去最上层的血浆,收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞,尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中,用毛细吸管轻轻吹判均匀,避免产小气泡,液柱高度不超过离心管的2/3。混匀后离心1500r/min离心10min,低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液。

注意:还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走,注意不要碰到雾状层,然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法,比较简单一些。

再用同样洗涤液洗涤细胞2次,1500r/min离心10min,洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次,吸尽上清,以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank′s液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液3~4 mL) 重新混悬细胞37℃、5% CO2孵育箱中培养2 ~3 h后去除上清,得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液3~4 mL,按需调定细胞密度, 于37℃、5% CO2孵育箱中培养备用。

4.       单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定

取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56 等检查,以测定所得细胞的纯度。取1 滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1 滴2%台盼蓝染液混匀,加盖片,显微镜高倍镜检,活细胞不着色,折光强;死细胞被染成蓝色,体积略膨大。


在线客服
 
 
 联系方式
陈军:021-60526354
小余:021-60345312
小吴:021-60345367