PCR反应的影响因素 变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃ 20~30秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热DNA聚合酶的活力，最高变性温度不宜超过95℃。 退火温度与时间：退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30~60秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。 延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间，延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增2 Kb片段，若使用Taq酶只需1分钟，使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。 循环次数：可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设定20-40个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。 酶量：50 μL反应体系可用0.5-5 U酶，酶量的选择与模板DNA的量，扩增片段大小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降。 模板：模板可以是单链DNA，也可以是双链DNA，质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多，不超过1 μg为宜，因为加量过多可能导致非特异性扩增增加，但是要考虑模板中靶序列的含量。例如，使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列，就需要适当加大模板用量。 引物：引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸，最高不宜超过30个核苷酸，最佳长度为20~24个核苷酸，如需插入酶切位点，应在酶切位点5’端多加几个碱基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构，如发夹结构。两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端。如果可能，引物3’端最好富有GC，这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好经过色谱层析纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2 μM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太低则扩增产物太少。 | 
