人25羟基维生素D3(25(OH)D3/25 HVD3)ELISA试剂盒试验原理

英文名称：Human  25-Dihydroxy vitamin D3,HVD3 ELISA试剂盒

本试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中指标的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制：

自备材料：

1．   蒸馏水。

2．   加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。

3．   振荡器及磁力搅拌器等。

人25羟基维生素D3(25(OH)D3/25 HVD3)ELISA试剂盒样品收集、处理及保存方法：

1、   血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、   血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、   细胞上清液---1000×g离心10分钟除颗粒和聚合物。

4、   组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5、   保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

操作注意事项：

l       试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

l       实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

l       不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

l       使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

l       使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

l       底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

l       加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

安全性：

1．   避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．   实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3．   不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

人25羟基维生素D3(25(OH)D3/25 HVD3)ELISA试剂盒试剂盒性能：

1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

操作步骤：

1．   使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．   根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．   加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．   甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．   每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．   甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．   每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．   取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．   在450nm波长处测定各孔的OD值。

结 果 判 断 与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度, 再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。